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牛奶營養(yǎng)成分豐富，是人們日常生活中重要的營養(yǎng)來源之一。為消滅牛奶中對人體有害的微生物和酶，工業(yè)生產(chǎn)中會對牛奶進行熱處理,而牛奶中的乳清蛋白經(jīng)熱處理后極易發(fā)生變性，使其活性蛋白喪失活性。巴氏殺菌和超高溫瞬時滅菌(UHT)仍是國內外目前乳制品熱處理的主要方式,隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的不斷發(fā)展，蒸汽侵入式直接殺菌(INF)技術成為目前國際上一種先進的牛奶殺菌方式，該技術將牛乳在159℃、0.09 s條件下瞬時加熱，采用此技術制備牛奶，對蛋白質等營養(yǎng)物質的破壞度小，營養(yǎng)成分保留更高，口感更新鮮。美拉德反應是液態(tài)乳殺菌過程中的重要反應之一，其產(chǎn)物會對乳品質量產(chǎn)生較大影響。美拉德反應的兩個產(chǎn)物糠氨酸和羥甲基糠醛(HMF),分別是作為反應指示物的初始產(chǎn)物，以及作為反應進行程度評價指標的中間產(chǎn)物。乳果糖可鑒別不同熱處理牛乳，目前國際上通常用糠氨酸和乳果糖作為評估熱處理對奶制品質量影響的指標。本研究通過對INF殺菌乳及其他3種常見熱處理滅菌乳的研究，分析不同熱處理方式對牛奶乳清蛋白的影響，包括活性蛋白組成、含量及微觀結構的改變，從而提高消費者對熱處理滅菌乳的認識，改變消費理念，這也與我國目前提倡的“國家優(yōu)質乳工程”相契合。

LC-20AD型高效液相色譜儀；pH計(精度0.1);離心機(轉速≥10 000 r/min);ME204分析天平;1600PC紫外-可見分光光度計；S-3400N掃描電子顯微鏡(SEM),HITACHI;IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀，SHIMADZU;日立F-2700熒光光譜分析儀；Zetasizer Nano S90納米粒度測定儀，Malvern; FW-4A 粉末壓片機；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱。

磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙酸銨、辛醇、過氧化氫(質量分數(shù)為30%)、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸銨、硫酸鎂(均為分析純);冰醋酸(優(yōu)級純，室溫保存)、三氟乙酸(色譜純，99.9%,4℃保存)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、肝素親和柱(4℃冰箱內儲存)。

奶場牛乳：當天采集，不進行任何熱處理；巴氏殺菌乳：取奶場牛乳于65℃的水浴鍋中加熱30 min; INF殺菌乳：取奶場牛乳在157℃的條件下加熱0.09 s; UHT滅菌乳：取奶場牛乳于137℃下加熱處理4 s。

將1.3中的4種熱處理牛奶樣品進行離心脫脂，離心條件為4℃、10 000 r/min離心10 min, 棄去上層脂肪后得到脫脂乳。利用酸等電點沉淀離心法制備乳清蛋白：用1 mol/L HCL將脫脂乳的pH調至4.6,于4℃、5 000 r/min離心20 min,取上清液密封置于-20℃冰箱內待測。

精確稱取各樣品20 g(精確到0.001 g)置于50 mL容量瓶中，加入適量pH為6.5的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(流動相A),超聲提取20 min, 冷卻至室溫后用pH為2.5的甘氨酸鹽酸緩沖液(流動相B)定容，搖勻后將樣品移至離心管4℃ 10 000 r/min離心10 min。取過濾液2.5 mL,通過Pharmacia HI-Trap Protein G柱凈化后定容至1.5 mL,液相色譜分析。采用色譜柱CAPCELL PAK C18(4.6m mL.D.×250 mm, 5 μm)等度洗脫，流動相為乙腈：0.1%三氟乙酸=6:4,流速為1 mL/min, 進樣體積為20 μL,在紫外280 nm下進行檢測。

參考河北省奶業(yè)協(xié)會發(fā)布的《活性蛋白牛乳(牛)》中的方法對4種牛奶中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行測定。取1.4中制備的4種乳清蛋白各1 mL稀釋10倍后，過0.22 μm濾膜，上機待測。采用色譜柱：BEH300 C4(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 300 ?),進行梯度洗脫分離。流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速為0.3 mL/min, 進樣體積為10 μL,在紫外280 nm下檢測。

(1)配制由84 mmol/L Na2HPO4和16 mmol/L NaH2PO4制成的結合緩沖液。(2)精確稱取5 g牛奶樣品于100 mL三角瓶中，加入30 mL結合緩沖液渦旋振蕩1 min后移至50 mL容量瓶，加入結合緩沖液定容；(3)將樣本移至離心管，離心條件為4℃、12 000 r/min、10 min, 使用移液器輕輕吸出10～30 mL中間液作為樣品提取液；(4)配制由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaCl制成的淋洗液以及由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、1 mol/L NaCl制成的洗脫液；(5)加5 mL結合緩沖溶液于肝素親和柱內進行平衡，加樣品提取液，待其完全流出后，加入10 mL淋洗液，并棄去全部流出液，再加入2.5 mL洗脫液，收集全部流出液，并定容至3.5 mL,過濾膜供液相色譜檢測用。(6)采用色譜柱：BEH300 C4(Waters, 100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 300 ?)進行梯度洗脫。流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速為0.45 mL/min, 進樣體積為10 μL,在紫外280 nm下檢測。

參考NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》測定糠氨酸含量。吸取1.3中4種不同熱處理的牛奶各2 mL和10.6 mol/L鹽酸溶液6 mL一同加入密閉耐熱試管中，混勻后將試管置于干燥箱，110℃下加熱水解12 h以上，加熱結束后，冷卻過濾，濾液為水解液。吸取1 mL水解液于試管中，加入6 g/L乙酸銨溶液5 mL,混勻后過0.22 μm水相濾膜，濾液上機測定。采用色譜柱：C18硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)梯度洗脫、流動相A為0.1%三氟乙酸溶液、流動相B為甲醇，流速為1 mL/min, 進樣體積為10 μL,在紫外280 nm下檢測。

采用Ellman’s 5,5’-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸，DTNB)法測定不同熱處理后乳清蛋白溶液的表面巰基含量。稱取適量樣品，溶于蒸餾水配制成質量濃度為2 mg/mL的溶液，吸取1 mL蛋白溶液，加入4.0 mL Tris-甘氨酸緩沖液I和50 μL Ellman’s試劑，混合均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)15 min; 并于412 nm波長下測定吸光度。

參考NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》測定乳果糖含量。

室溫下采用Malvern納米粒度測定儀進行粒徑分布的測定。將4種乳清蛋白樣品用去離子水稀釋5倍，調整顆粒折射率為1.59,分散劑折射率為1.33,分散劑吸收率為0.887 2。

將4種乳清蛋白溶液用去離子水稀釋適當?shù)谋稊?shù)，設置激發(fā)波長為290 nm, 在此波長下進行發(fā)射波長的掃描，掃描光譜范圍為300～450 nm, 掃描速度為60 nm/min, 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

取1.4中4種熱處理牛奶乳清蛋白各5 mL樣品平鋪于培養(yǎng)皿中，冷凍干燥48 h制成凍干粉。用稱量勺挑取少量凍干粉樣品置于粘有雙面膠的樣品臺上，用洗耳球吹去附著的和未固定牢的樣品，噴金120 s后用掃描電鏡觀察。

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定蛋白質的二級結構。準確稱取1.5 mg 1.8.3中的凍干粉樣品置于瑪瑙研缽中，再稱取150 mg干燥的溴化鉀(樣品：溴化鉀=1:100),研磨均勻后用壓片機制成供試片備用。測定時將供試片置于紅外光譜儀的樣品光路中，設置分辨率為4 cm-1,在波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1進行掃描，掃描次數(shù)為32次，利用Origin 2021對紅外光譜進行分峰擬合計算。

如圖1可知，奶場樣品中乳清活性蛋白總量在4種不同熱處理樣品中最高，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均為最高，分別為1 413.3 、4 024.4 mg/L。UHT滅菌乳中乳清活性蛋白總量最低，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均為最低，分別為116.2、378.9 mg/L,且乳鐵蛋白和免疫球蛋白基本沒有檢出。INF殺菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的含量與巴氏殺菌乳相當，但免疫球蛋白含量低于巴氏殺菌乳。從4種不同熱處理牛奶中乳清活性蛋白的含量可以看出，隨著熱處理溫度的升高和時間的增加，乳清蛋白中活性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢。

由表1可知，奶場樣品中乳果糖和糠氨酸含量均為最低，分別為7.25 、3.65 mg/100 g; 巴氏殺菌乳和INF殺菌乳中兩者含量基本相當；UHT滅菌乳中兩者含量均為最高，分別為13.97 、166.3 mg/100 g, 其中糠氨酸含量是其他熱處理牛奶的10倍以上。Leen Mortier等對比利時市場上的各種奶類共154個奶樣進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，UHT滅菌乳中的平均乳果糖和糠氨酸含量是巴氏殺菌乳中的10倍以上，具有顯著性差異，這也與本實驗的結果一致。由圖2可知，UHT滅菌乳中表面巰基含量最高，為52.7 μmol/L,奶場樣品中含量最低，為17.5 μmol/L,巴氏殺菌乳和INF殺菌乳中表面巰基含量相當，分別為27.8 、32.9 μmol/L。牛乳中約90%的巰基位于β-乳球蛋白上，每個β-乳球蛋白單體均含有1個游離巰基及2個二硫鍵，β-乳球蛋白隨著熱處理溫度的升高以及加熱時間的增加，發(fā)生熱變性，從而使其分子鏈展開，將其巰基暴露出來，故表面巰基的含量逐漸增加。

由圖3可知，4種不同熱處理的牛奶樣品中，UHT滅菌乳的乳清蛋白平均粒徑最大，其次是INF殺菌乳，巴氏殺菌乳和奶場樣品的乳清蛋白平均粒徑大小相當。粒徑是影響牛奶穩(wěn)定性的重要因素之一，不同熱處理方式牛奶中的乳清蛋白會發(fā)生不同程度的變性，導致蛋白的平均粒徑發(fā)生變化，這可能是因為乳清蛋白分子之間生成凝聚物。

由表2可知，本試驗中4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白最大熒光強度均>330 nm, 由Halder U C等的研究可知，最大熒光強度值反映色氨酸殘基的微環(huán)境，當色氨酸殘基處于蛋白質分子外部的極性環(huán)境中時，最大熒光強度值>330 nm, 故本實驗4種熱處理牛奶的乳清蛋白均處于極性環(huán)境中。與奶場樣品相比，巴氏殺菌乳和INF殺菌乳的最大熒光強度值無明顯變化，而UHT滅菌乳的乳清蛋白最大熒光強度大于其他3種熱處理奶樣，可能是因為UHT滅菌乳經(jīng)高溫較長時間熱處理后，導致維持蛋白質構象的疏水相互作用被破壞，蛋白的極性環(huán)境增加。3種熱處理牛奶相較奶場樣品其乳清蛋白熒光強度均有降低，雖然INF殺菌乳熱處理溫度最高，但其加熱時間不足1 s, 明顯小于UHT滅菌乳的加熱時間，故UHT滅菌乳蛋白質結構破壞嚴重，其熒光強度降低最為顯著。

圖4為4種不同熱處理牛奶乳清蛋白的掃描電鏡圖，其中圖A為未經(jīng)熱處理的奶場樣品，可以看出其蛋白質結構大小比較均勻，表面比較光滑。與圖A相比，圖B到圖D開始呈現(xiàn)更不規(guī)則且無序的結構，其中UHT殺菌乳的乳清蛋白結構明顯增大且有片層出現(xiàn)，這可能是因為高溫較長時間的加熱可以破壞蛋白質非共價力，導致多層聚集體和大聚集體的形成。對大豆蛋白進行干熱處理，掃描電鏡結果也顯示樣品呈現(xiàn)出多層片狀的破碎結構。

參考相關文獻可知，蛋白質二級結構中，1 645～1 658 cm-1為α-螺旋結構，1 665～1 680 cm-1為β-折疊結構，β-轉角結構在1 640～1 644 cm-1和1 681～1 690 cm-1,無規(guī)則卷曲結構在1 659～1 664 cm-1。采用Omnic 8.2軟件得到4種不同熱處理牛乳乳清蛋白的紅外光譜分析圖，再用PeakFit 4.2計算各二級結構含量。由圖5可知，隨著熱處理溫度的升高，1 600～1 700 cm-1間子峰的強度發(fā)生改變，說明4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白二級結構發(fā)生了變化。結合表3可得，奶場樣品的α-螺旋結構最多，為39.06%,經(jīng)過UHT滅菌后，其含量降低至13.81%,隨著溫度和熱處理時間的增加，α-螺旋有著明顯降低的趨勢。巴氏殺菌乳和INF殺菌乳的二級結構組成基本相當。從表3還可以看到，無規(guī)則卷曲在奶場樣品中最低為7.02%,在UHT滅菌乳中組成最高，為29.61%。蛋白質分子外部環(huán)境變化導致蛋白質二級結構的改變，使其發(fā)生構象改變和折疊。α-螺旋是最常見也是最穩(wěn)定的蛋白質二級結構，隨著熱處理溫度的升高，α-螺旋的逐漸減少可能是由于蛋白熱變性導致α-螺旋氫鍵斷裂，發(fā)生解螺旋。無規(guī)則卷曲的增多表明，乳清蛋白結構的隨機性隨熱處理增強，使有序結構逐漸向無序結構轉化。

本試驗通過對4種不同熱處理牛奶的乳清蛋白含量、微觀結構及美拉德反應產(chǎn)物含量等方面進行研究，結果發(fā)現(xiàn)：(1)奶場牛奶乳清活性蛋白總量最高，UHT滅菌乳含量最低。INF殺菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的含量與巴氏殺菌乳相當。(2)UHT滅菌乳中糠氨酸和乳清蛋白溶液表面巰基含量均明顯高于其他3種熱處理奶樣，乳果糖含量略高于其他3種奶樣。INF殺菌乳中乳果糖、糠氨酸及表面巰基含量均與巴氏殺菌乳相當。(3)4種熱處理牛奶中，巴氏殺菌乳、INF殺菌乳及UHT滅菌乳的粒徑大小較奶場樣品有不同程度的增加，其中UHT滅菌乳的增加最為顯著；UHT滅菌乳中乳清蛋白極性環(huán)境的增加大于其他3種熱處理牛奶。(4)隨著熱處理時間和溫度的增加，4種牛奶乳清蛋白二級結構中α-螺旋逐漸減少，無規(guī)則卷曲逐漸增加，乳清蛋白結構從有序向無序轉化。INF殺菌乳和巴氏殺菌乳的變性趨勢基本一致，優(yōu)于UHT滅菌乳。