晚期糖基化末端產(chǎn)物(advanced glycation endproducts,AGEs)是在食品加工和貯藏過(guò)程中，通過(guò)美拉德反應(yīng)生成的一類不可逆的共價(jià)化合物。研究發(fā)現(xiàn)一些疾病如糖尿病及其并發(fā)癥、動(dòng)脈硬化、腎功能障礙、心血管疾病等是由AGEs引起的。在食品熱加工過(guò)程中，如巴氏殺菌、高溫殺菌、烘烤和油炸等過(guò)程容易形成AGEs。因此如何控制食品加工過(guò)程中AGEs形成顯得尤為重要。
UHT奶經(jīng)過(guò)超高溫瞬時(shí)滅菌后，具有常溫貯存時(shí)間長(zhǎng)、銷售方便的優(yōu)點(diǎn)。但是UHT奶加工和貯藏過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的產(chǎn)物AGEs，如何降低UHT奶加工過(guò)程中產(chǎn)生的AGEs是急需解決的問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物除具有較好抗氧化作用外，同時(shí)具有顯著抗糖基化活性，如芹菜素、蘆丁、沙棘籽渣黃酮、玉米須黃酮等黃酮類物質(zhì)對(duì)AGEs具有較高抑制作用，但是黃酮類物質(zhì)應(yīng)用于乳制品生產(chǎn)過(guò)程中的AGEs的抑制作用未見(jiàn)報(bào)道。針對(duì)UHT奶在生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中AGEs的形成因素及控制鮮見(jiàn)報(bào)道的現(xiàn)狀，本研究以UHT奶為對(duì)象，以UHT奶中熒光性AGEs含量為指標(biāo)，考查加工條件（糖種類、糖添加量）、貯藏條件（溫度和時(shí)間）以及添加食源性黃酮（槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素）對(duì)UHT奶生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中AGEs形成的影響，以期控制UHT奶生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中的AGEs，旨在為UHT奶的安全生產(chǎn)提供參考。
原料乳；槲皮素、蘆丁、染料木素、兒茶素；磷酸氫二鈉；蔗糖、果糖、葡萄糖、果葡糖漿，蔗糖脂肪酸酯、單甘油脂肪酸酯。
酶標(biāo)儀，均質(zhì)機(jī)，；高速離心機(jī)；Agilent LC-MS；恒溫恒濕培養(yǎng)箱；超高溫瞬時(shí)殺菌系統(tǒng)；p H計(jì)。
進(jìn)行熒光性AGEs含量的測(cè)定。將2 m L UHT奶和4 mL甲醇混勻后在-80℃的條件下保存1 h，然后離心（1 3000 r/min,30 min），取0.3 mL上清液，在λex/λem=340 nm/465 nm波長(zhǎng)處測(cè)定熒光值,λex為熒光激發(fā)波長(zhǎng)340nm處的熒光值；λem為熒光發(fā)射波長(zhǎng)465 nm處的熒光值。以磷酸鹽緩沖溶液作為對(duì)照，每組樣品重復(fù)3次。
原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯），然后分別加入添加量為2%的果糖、蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿，充分混勻后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137℃條件下進(jìn)行UHT殺菌，殺菌時(shí)間4 s，然后取UHT奶樣品按照1.3.2節(jié)的方法測(cè)定熒光性AGEs含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3次。
原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯），然后分別加入添加量為2%、4%、6%、8%的蔗糖，充分混勻后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137℃條件下進(jìn)行UHT殺菌，殺菌時(shí)間4 s，然后取UHT奶樣品按照1.3.2節(jié)的方法測(cè)定熒光性AGEs含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3次。
原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，然后加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混勻后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137℃條件下進(jìn)行UHT殺菌，殺菌時(shí)間4 s，滅菌完成后取出冷卻至室溫。將UHT奶分別貯藏在4、25℃和37℃的培養(yǎng)箱中，于0、5、15、30、60 d后取樣，樣品按1.3.2節(jié)的方法測(cè)定AGEs含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3次。
原料奶經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后過(guò)濾、冷卻、貯存，然后加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯）和2%的蔗糖，充分混勻后，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4、6和8%的槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素，經(jīng)過(guò)過(guò)濾均質(zhì)，然后在137℃條件下進(jìn)行UHT殺菌，殺菌時(shí)間4 s，然后取UHT奶樣品按照1.3.2節(jié)的方法測(cè)定熒光性AGEs含量，以磷酸鹽緩沖溶液代替UHT奶作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3次。
每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)取平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，作圖采用Origin8.0軟件，利用spss20軟件處理數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行方差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（P<0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。
糖種類對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，不同糖對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的影響較大。與蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿相比，果糖對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的生成起到明顯的促進(jìn)作用（P<0.05），蔗糖對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的生成的促進(jìn)作用最?。≒<0.05），有利于降低AGEs的生成。這4種糖對(duì)AGEs的生成促進(jìn)作用由大到小依次為果糖、葡萄糖、果葡糖漿和蔗糖，促進(jìn)AGEs的生成的原因是因?yàn)閱翁?、低聚糖等受熱自身發(fā)生焦糖化反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮醛（methylglyoxal,MGO），糖自身發(fā)生羥醛縮合和自氧化生成乙二醛（glyoxal,GO)。MGO和GO又進(jìn)一步與蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)系列反應(yīng)生成戊糖素、類黑素以及羧甲基賴氨酸等AGEs。因此，本實(shí)驗(yàn)中的糖原料中單糖比如葡萄糖、果糖和果葡糖漿與蔗糖相比，更易發(fā)生糖基化反應(yīng)形成熒光性AGEs，因此為了減少熒光性AGEs的生成，蔗糖適宜作為UHT奶加工過(guò)程中的糖原料。
在確定蔗糖作為適宜生產(chǎn)UHT奶的原料的基礎(chǔ)上，需要確定蔗糖合適的添加量。蔗糖添加量對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的影響見(jiàn)圖2，從圖2可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，UHT奶中熒光性AGEs生成量逐步增高。當(dāng)蔗糖添加量在0%～4%范圍時(shí)，隨著蔗糖添加量的增加，熒光性AGEs生成量明顯增加（P<0.05），原因可能是隨著糖添加量的增加，促進(jìn)了蛋白糖基化反應(yīng)。當(dāng)蔗糖添加量在4%～8%范圍時(shí)，隨著蔗糖添加量的增加，熒光性AGEs生成量有一定程度的增加，但是增加不明顯（P>0.05）?？赡苁且?yàn)殡S著蔗糖添加量（大于4%）進(jìn)一步增加，形成熒光性AGEs的量呈現(xiàn)基本飽和狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到最高值。因此適宜的蔗糖添加量為2%。
貯藏溫度和時(shí)間對(duì)UHT奶中熒光性AGEs的影響見(jiàn)表1，從表1可以看出，UHT奶在貯藏60 d內(nèi)，熒光性AGEs生成量隨著貯藏溫度的提高及貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。貯藏期在30 d內(nèi)，UHT奶中熒光性AGEs生成量隨著貯藏溫度的提高及貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)差異顯著（P<0.05）。在相同貯藏時(shí)間、溫度不同條件下，UHT奶中熒光性AGEs生成量差異顯著（P<0.05）。在4、25℃和37℃條件下，15 d內(nèi)熒光性AGEs生成量增幅較大，貯藏時(shí)間超過(guò)15 d，熒光性AGEs生成量變化不大。25℃和37℃條件下，貯藏期為30 d時(shí)，UHT奶中熒光性AGEs形成量分別是4℃條件下的1.07倍和1.13倍。原因可能是貯藏溫度越高，促進(jìn)了UHT奶中糖類物質(zhì)發(fā)生羥醛縮合，促進(jìn)脂肪發(fā)生氧化，使得生成更多的1,2-二羰基化合物，導(dǎo)致產(chǎn)生越多的AGEs。隨著溫度增加AGEs產(chǎn)量差值增加量逐漸減小，是因?yàn)闇囟壬呱葾GEs所需的底物越來(lái)越少，溫度增加導(dǎo)致AGEs生成量增加不明顯。由此，UHT奶低溫存放更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs的生成。
注：不同小寫(xiě)字母表示不同溫度之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；不同大寫(xiě)字母表示不同貯藏時(shí)間之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
黃酮對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的影響見(jiàn)表2，從表2可以看出，隨著黃酮添加量的增加，UHT奶中熒光性AGEs生成量顯著減少（P<0.05）。4種黃酮對(duì)降低熒光性AGEs的生成的效果排序?yàn)椋禾J丁>槲皮素>染料木素>兒茶素。以蘆丁為例，當(dāng)添加量由4%增加到8%時(shí)，熒光性AGEs的生成量降低了40.7%。黃酮能夠抑制UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的生成，可能是因?yàn)辄S酮能夠結(jié)合中間產(chǎn)物1,2-二羰基化合物，從而阻斷由1,2-二羰基化合物介導(dǎo)生成AGEs的路徑，另外可能是因?yàn)辄S酮具有抗氧化作用，從而通過(guò)抗氧化作用阻斷由自由基引發(fā)的合成AGEs的路徑。
表2 黃酮對(duì)UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中熒光性AGEs的影響
注：不同小寫(xiě)字母表示不同溫度之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；不同大寫(xiě)字母表示不同貯藏時(shí)間之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
本文以UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中晚期糖基化末端產(chǎn)物調(diào)控為核心，闡明了在UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中，糖（包括糖種類、糖添加量）、貯藏條件（溫度和時(shí)間）以及添加食源性黃酮（槲皮素、蘆丁、染料木素和兒茶素）對(duì)UHT奶中AGEs生成的影響，結(jié)果表明糖對(duì)AGEs的生成促進(jìn)作用由大到小依次為果糖、葡萄糖、果葡糖漿和蔗糖，為了減少熒光性AGEs的生成，蔗糖適宜作為UHT奶加工過(guò)程中的糖原料。隨著蔗糖添加量的增加，UHT奶中熒光性AGEs生成量逐步增高。因此，在UHT奶加工過(guò)程中，減少糖的添加量可以大大減少熒光性AGEs的形成。適宜的蔗糖添加量為2%。UHT奶低溫貯藏（4℃）、減少貯藏時(shí)間（貯藏時(shí)間不易超過(guò)15 d，）更有利于抑制蛋白糖基化，降低AGEs的生成。在UHT奶加工過(guò)程中，食源性黃酮具有明顯的抑制AGEs的生成，并且隨著黃酮添加量的增加，UHT奶中熒光性AGEs生成量顯著減少（P<0.05）。4種黃酮對(duì)降低熒光性AGEs的生成的效果排序?yàn)椋禾J丁>槲皮素>染料木素>兒茶素。蘆丁具有較好的抗糖化作用，適宜作為一種UHT奶貯藏過(guò)程中天然有效的AGEs抑制劑。
該研究聚焦UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中晚期糖基化末端產(chǎn)物調(diào)控，闡明了影響UHT奶生產(chǎn)過(guò)程中影響熒光性AGEs生成的影響因素，從而為有效調(diào)控UHT奶生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中有害物質(zhì)的產(chǎn)生，為UHT奶的安全生產(chǎn)提供了參考。
